祛痘化妆品祛痘功效评价方法的研究

    摘要：根据疗效化妆品的发展趋势和青春痘生成机理，提出用抑菌试验方法来评价祛痘化妆品的祛痘功效，同时应用这种方法来评价自制的祛痘化妆品功效，最后指出了该方法的优缺点。
    关键词：化妆品；祛痘评价方法；抑菌试验；痤疮丙酸杆菌
    中图分类号：TQ658    文献标识码：A    文章编号：1006-7264（2004）12-0021-04

    化妆品是人们日常生活的必需品。它对护理皮肤、改善肤质和提升人们的气质，有着不可替代的作用。随着科学技术的发展和时代的进步，人们对它的期望也越采越高。过去的20年，中国的化妆品生产和消费紧随国际潮流，每年以高于15％的速度发展。其中功能性、疗效型的产品发展更为迅速。
    疗效化妆品是化妆品的重要类别。1990年以后，世界各国更多地关注重视此类产品。这是因为，人们健康意识的提高，现代药物天然替代品的加强，人们寻求新的方式缓解现代生活的压力，化妆品、盥洗用品与药物的界线不再日益明显。
    疗效化妆品在美国被列为非处方药品（OTC药品）。日本厚生省把这类化妆品列为医药部外品或药用化妆品。
    在国内1995年新修订的化妆品标准给了疗效化妆品发展的空间。新标准增加了化妆品的“保养”作用和“缓和”的特殊作用。疗效化妆品是介于药品和普通化妆品之间的产品，如祛痘（抗痤疮）产品、祛斑产品、脱毛剂和驱虫剂等。

1 抑菌试验方法提出的必要性
    从近几年国内市场看祛痘化妆品晶牌品种不少，比如：采诗祛痘水和祛痘膏、七日香祛痘水、祛痘霜和祛痘面膜等。从文献报道看，国内化妆品公司在祛痘化妆品研制方面的报道较少，对于祛痘化妆品功效评价方法的报道更难于见到，而全国各大小医院有关祛痘药品研制报道的较多，对于祛痘药品疗效判定标准也稍有介绍。综合目前报道的祛痘药品疗效判定标准来看，普遍都是按照“卫生部皮肤病药物临床研究指导原则（征求意见稿）”来进行分级判定的：
    ①痊愈；皮损消退；②显效：皮损消退>60％；③有效：皮损消退>20％—60％；④无效：皮损消退<20％或加重。
    该判定方法是在医生指导下对祛痘药品进行的临床试验方法，对于研制祛痘化妆品的企业来说实施不够快捷方便，尤其在筛选多个祛痘功效成分和配方时会耗费较长的试验时间。还有疗效型的祛痘化妆品毕竟是化妆品，主要起清洁、美化和缓和作用，而不是药品，套用卫生部皮肤病药物临床研究指导原则不是很合适。所以，采用一种方便快捷的新方法来评价祛痘化妆品功效是非常必要和必须的。经过反复试验和研究，提出参照中华人民共和国国家标准GBl5797—2002 “一次性使用卫生用品卫生标准”中附录C4“溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能试验方法”来评价祛痘化妆品的祛痘功效。

2  抑菌试验方法的理论依据

2.1  青春痘的形成和发生机理
    青春痘是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症，常见于青春发育期的青年男女，主要发生在面部、前胸及肩胛部位，形成丘疹，中医称“粉刺”，西医病名为“痤疮”。
    青春期雄性激素增多，皮脂腺分泌增多，同时使毛囊、皮脂腺异角化过度，角质层脱落的扁平的死细胞落下毛囊漏斗部，与皮脂结合，产生混合物。如果这些混合物不能自由排出皮肤表面，而淤积于毛囊内形成脂栓。当这些异常角化细胞聚集，下部漏斗膨胀时就形成成熟的粉刺。皮脂被毛囊中存在的细菌分解，产生脂肪酸，后者刺激毛囊引起炎症，致使毛囊壁损伤破裂，毛囊内容物进入真皮，从而，引起毛囊周围程度不等的炎症反应。
    青春痘的发生机理，与以下三大因素有关：
    （1）对雄性激素类固醇（如睾酮、去氢表雄酮、羟孕酮）反应的原因不明性加剧，致使皮脂产生增多。
    （2）痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium  acnes）增生。
此菌为毛囊正常菌群组成，它以皮脂为其作用机质，并使之部分转化为游离脂肪酸（FFA）。痤疮丙酸菌还可激活补体通路，至少产生两种趋化因子，促使炎症发生。
    （3）囊上皮细胞数量增多，并有黏着性，形成毛囊潴留性角化过度。后者发生原因仍未明晰。痤疮丙酸菌产生游离脂肪酸，可能是青春痘形成的主要因素。

2.2  细菌与青春痘
    近几年国内外均有报道细菌与青春痘的文章。中山医科大学附属三院皮肤病学教授徐广坤指出：痤疮的发病因素是多方面的，内分泌只是其中的一个因素。在粉刺发生炎症的过程中，细菌起着十分重要的作用。在皮肤表面和皮脂腺毛囊中，可能存在着一些微生物，常见的有痤疮杆菌、表皮葡萄球菌和糠秕孢子菌，以痤疮杆菌与痤疮炎症的发生关系最大。
    英国的Nishijima S在其“寻常性痤疮的细菌学及皮损中痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的药敏研究”文章中报道，在痤疮皮损中除痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌外，还可分离出其他细菌，但只有痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌这两种菌在痤疮形成的不同阶段都存在，而且从第一阶段无炎症的黑头粉刺到严重的脓庖、结节，都可特征性地查到这两种菌；有报道在黑头粉刺中可查到痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和糠秕马拉色菌，如果这3个菌都没有查到，则可能是检查方法有错误。作者的研究中有一半的皮损可同时分离出痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌。因此，认为这两种菌是各种痤疮皮损的主要菌种，而另外的菌种可能是表皮的污染菌种。

3  抑菌试验方法的介绍

3.1  供试菌种
    金黄色葡萄球菌ATCC 6538；绿脓杆菌ATCC9027：大肠杆菌ATCC 8739；  白色念珠菌ATCC10231；糠秕小孢子菌；痤疮丙酸杆菌。

3.2  培养基与培养条件
    普通营养琼脂培养基（37℃、48h培养，用于金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌培养）；沙氏琼脂培养基（30℃、3天培养，用于白色念珠菌培养）；改良沙保弱氏琼脂培养基（30℃、3天培养，用于糠秕小孢子菌培养）：葡萄糖营养液（37℃、48h厌氧培养，用于痤疮丙酸杆菌培养）。

3.3  试验方法
    参照中华人民共和国国家标准GBl5797—2002“一次性使用卫生用品卫生标准”中附录C4  “溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能试验方法”。

3.3.1  操作步骤
    （1）试验菌24h（细菌）和5天（真菌）培养物用0.03mol／L PBS洗下，制成10的6次方cfu／mL菌悬液。
    （2）取被试样品1g加入上述菌悬液0.1ml,均匀涂布混合，开始计时20min后，加  9ml0.03mol／L PBS充分混匀，作适当稀释后，取其中2个-3个稀释度，分别取1ml,置于两个平行平皿内，再加入相应培养基分别混菌培养。作菌落记数。以上试验重复3次，取其平均数，同时设空白对照。
    计算：
    X=（A－B）／A×l00％
    式中：X—抑菌率，％
    A－对照样品平均回收菌落；
    B—试验样品平均回收菌落。
    （3）结果报告抑菌率≥50％～90％，产品有抑菌作用；抑菌率≥90％，产品有较强抑菌作用。

3.4  祛痘功效评价
    功效评价分三级：显效、有效和无效。当祛痘化妆品对表1所示各种菌种抑菌率均达到≥90％，判定为能显著有效地预防和抑制青春痘产生；祛痘化妆品对表1所示前3种菌种的抑菌率达到≥90％和对后3种菌种的抑菌率达到≥50％-90％，判定为能有效地预防和抑制青春痘产生；只要祛痘产品对后3种菌种的抑菌率<50％，则判定为无效，概括如表10。

4  抑菌方法的应用
4.1  自制祛痘水和祛痘霜

4.1.1  功能剂的添加
    一般而言，祛痘产品添加的功能剂决定产品的功效。祛痘水和祛痘膏中分别添加功能剂Melaleucol和功能剂－F。功能剂Melaleucol是一种100％纯天然产品，是从澳洲药用等级的茶树油蒸馏而得，具有广泛抗菌效果和良好的消炎性。与茶树油比较，功能剂Melaleuc。l对特定微生物有更强的抗菌力，如：痤疮丙酸杆菌和棒状杆菌群等。功能剂－F是来自法国某生物实验中心的最新研制成果，具有广泛的抑菌力,对皮肤无刺激，无毒副作用，能对抗革兰氏阴性及阳性细菌、真菌类，可作为皮肤杀菌剂.

    表1   祛痘功效评价
    Tab.1  Anti-acne protection evaluation
    菌种         抑菌率／％
    绿脓杆菌ATCC 9027
    大肠杆菌ATCC 8739    ≥90    ≥90
    白色念珠菌
    ATCC 10231
    金黄色葡萄球菌
    ATCC 6538            ≥90    ≥50—90    <50
    糠秕小孢子菌
    痤疮丙酸杆菌
    祛痘功效评价          显效    有效        无效

4.1.2  祛痘产品成分配比
    祛痘水和祛痘膏的成分配比如表2和表3

    表2  祛痘水成分配比
    Tab.2  1ngredients of anti-acne water
    成分              w/％
    Melaleucol            0.1～0.3
    食用酒精             5～10
    保湿剂               2～5
    增溶剂               0.8～1.5
    去离子水             至100

    表3  祛痘膏成分配比
    Tab.3  1ngredients of anti-acne cream
    成分                               w/％
    十八醇                                 2-6
    单甘酯                                 2-4
    乳木果油                               2-4
    GTCC                                  2-5
    甘油                                   5-8
    甲基葡萄糖苷倍半硬脂酸酯               l-2
    甲基葡萄糖苷聚氧乙烯醚倍半硬脂酸酯     1-2
    螯合剂                               0.01-0.02
    防腐剂                                0.1-0.2
    香精                                  0.2～0.3
    功能剂—F                          0.05-0.2
    去离子水                               至100

4.1.3  祛痘产品稳定性
    祛痘水是水剂型产品，外观为无色透明可流动液体。该类产品目前还没有国家标准和行业推荐标准，所以制定了企业内部标准，其理化指标包括：外观、香型、pH值和耐寒、耐热稳定性等。对产品稳定性考核要求如表4。

    表4  祛痘水稳定性考核表
    Tab.4  Testing stability of anti-acne water
    指标           时间／月       结果
    耐寒（0℃～5℃） 　 3  　　　液体透明、无沉淀
    耐热（50℃）    　　3    　　不变色、不变味、液体透明、无沉淀
  常温   　　    　 　6   　　　 不变色、不变味、液体透明、无沉淀
    祛痘霜是膏霜类产品，其稳定性符合ＧBl857雪花膏中各项指标要求。

4.2  抑菌试验结果
    按照上述新方法，对祛痘水和祛痘霜进行了20min的抑菌试验，结果见表5

    表5  祛痘水和祛痘膏抑菌试验结果
    Tab.5  Result of inhibiting bacteria testing of anti-acne  Water and cream
    抑菌率／％                祛痘水          祛痘膏
    绿脓杆菌ATCC 9027           100             100
    大肠杆菌ATCC 8739           100             100
    白色念珠菌ATCC 10231        96.4             95.1
    金黄色葡萄球菌ATCC 6538     100             100
    糠秕小孢子菌                 61.3             84.0
    痤疮丙酸杆菌                 70.0             77.6
    祛痘功效评价                 有效            有效
    性能试验结果表明，自制的祛痘水和祛痘膏能有效地预防和抑制青春痘的产生。

4.3  人群试用调查
    为测试产品的实际使用效果，对祛痘水和祛痘霜分别进行了人群试用调查。派发本品给有痤疮的人群试用1个月，同时填写调查问卷，最后统计结果。这是一种很直观的方法，同时能够检验祛痘产品对皮肤的刺激性，而且可以进一步验证抑菌性能试验结果的可靠性。人群试用调查结果如表6

    表6  人群试验调查结果
    Tab6  Result of survey
              试用结果／％
              祛痘水    祛痘霜
    显著有效      60       30
    有效          40       62
    无效           0        8
    人群试用结果表明，祛痘水能显著地预防和抑制青春痘产生，祛痘霜能有效地预
防和抑制青春痘产生，这与抑菌性能试验结果相符。 

5  抑菌试验方法的优劣    
    抑菌性能试验方法作为祛痘化妆品功效评价的—种方法，确实是简捷、方便和客观，能快速地筛选出祛痘功能剂和祛痘配方，适合要求快速应对市场变化的企业。不足之处在于只是对祛痘产品抑菌率的测试，而对祛痘产品涂抹于人体皮肤后的安全性和刺激性没有进行评价。这一点可以通过人群试用调查方法来弥补。还有，对抑菌性能试验结果显效或有效的产品再进行临床试验，则能更科学更全面地评价祛痘产品的功效。