关于＂微生物挑战性实验＂

标准菌及环境菌用于化妆品微生物挑战性实验

关键词：挑战性实验、混合标准菌激发实验、环境微生物激发实验
化妆品微生物挑战性实验（Microbial challenge testing）:又称化妆品微生物激发实验，指在模拟自然界微生物的生长环境条件下，按微生物生理特点进行设计，考察各类型化妆品中防腐体系对微生物的抑杀效果的试验。作为化妆品防腐体系功能性评价有效手段之一，在国外（特别是美国）应用已久，根据激发微生物的选择、微生物接种浓度、样品检测程序、有效性判定标准四个方面的差别，可分为USP法、CTFA法、FDA法。这些方法大都是分别选用单个菌种进行激发实验，工作量大而烦琐，而且没有充分考虑到实际生产环境微生物污染现实，为此我们经过长期探索，总结出一套适合国内化妆品公司研发、生产实际现状的微生物挑战性实验方法———混合标准菌和环境菌激发实验。
1 实验
1.1 USP法激发实验：
1.1.1 菌种及试剂：                                                                     铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugimosa）ATCC9027 ，大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922  ，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureues）ATCC6538 ，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404 ，白色假丝酵母(Candida albicans)ATCC10231：广东省微生物研究所提供；卵磷脂-吐温80-营养琼脂培养基（Litithin Tween 80 Agur） ，沙堡氏琼脂培养基，普通营养琼脂培养基广东环凯公司生产；卵磷脂、吐温-80均为分析纯。
1.1.2 检测程序：
1) 选取3—11代，黑曲霉菌菌种应提前七天转管活化、其余4种菌种应提前24小时转管活化后才能用于测试。
2) 实验样品的准备：                                                           取取待检样品A、B、C、D各250g，将供测试的样品分别称取50 g装入5个100ml灭菌锥形瓶中，用无菌棉塞封好。 
3) 菌种悬液的制备：把准备好的无菌生理盐水，加入3支细菌菌种斜面试管中，每管约4~6ml，然后用灭菌不锈钢勺柄分别把细菌菌苔刮洗下来（注意应将斜面上的菌膜一并洗出），在灭菌100ml锥形瓶中加入适量无菌生理盐水，最终制得3瓶细菌液菌量在1×108---5×108CFU/ml的菌悬液；把准备好的无菌生理盐水，分别倒入各真菌菌种斜面试管中，每管约4~6ml，然后用灭菌不锈钢勺柄将霉菌孢子、白色假丝酵母就菌苔轻轻刮洗下来，在灭菌100ml锥形瓶中混匀，盖上棉塞，制成1×108---5×108CFU/ml真菌孢子悬液。（菌悬液配制、浓度检测后随即使用，不可放置超过3小时）
4) 样品的接种、检测：在前面制备好的样品中，分别加入0.5ml混合细菌悬液和0.5ml混合真菌孢子悬液，充分搅拌均匀、无菌棉塞封好，然后将样品保存在28±1℃条件下，并于接种后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天分别测试样品中活细菌和活真菌含量。
5) 检测判定标准：在第14天，活的细菌浓度＜原浓度的0.1%；前14天，真菌浓度保持或低于原有浓度；第28天实验期，每次取样的微生物浓度保持或低于指定水平。


1.2 混合标准菌激发实验：  
1.2.1 标准菌及试剂：                                                                  铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugimosa）ATCC9027 ，大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922  ，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureues）ATCC6538  ，枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var niger）ATCC9372 ，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404 ，白色假丝酵母(Candida albicans)ATCC10231 ，绳状青霉(Penicillium funiculosum)GIM3.103 ，绿色木霉(Trichoderma viride)GIM3.139：广东省微生物研究所提供；卵磷脂-吐温80-营养琼脂培养基（Litithin Tween 80 Agur） ，马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA） ，沙堡氏琼脂培养基，普通营养琼脂培养基广东环凯公司生产；卵磷脂、吐温-80均为分析纯。
1.2.2 检测程序：
1) 标准菌种。选取3—11代，霉菌菌种应提前七天转管活化后才能用于测试，细菌菌种应提前24小时转管活化后才能用于测试。
2) 实验样品的准备：                                                           取取待检样品A、B、C、D各250g，将供测试的样品分别称取100 g装入两个250ml灭菌锥形瓶中，用无菌棉塞封好。 
3) 菌种悬液的制备：把准备好的无菌生理盐水，分别倒入各细菌菌种斜面试管中，每管约4~6ml，然后用灭菌不锈钢勺柄分别把细菌菌苔刮洗下来（注意应将斜面上的菌膜一并洗出），将4种细菌刮洗液 在灭菌100ml锥形瓶中混匀，盖上棉塞，制成混合细菌悬液一瓶，最终应控制细菌液菌量在1×108---5×108CFU/ml（上面制成的细菌菌悬液，根据其外观浊度通常再稀释还需6~10倍）；把准备好的无菌生理盐水，分别倒入各真菌菌种斜面试管中，每管约4~6ml，然后用灭菌不锈钢勺柄将霉菌孢子、白色假丝酵母的菌苔轻轻刮洗下来，在灭菌100ml锥形瓶中混匀，盖上棉塞，制成真菌孢子悬液。（菌悬液配制、浓度检测后随即使用，不可放置超过3小时）
4) 样品的接种、检测：在前面制备好的样品中，分别加入1ml混合细菌悬液和1ml混合真菌孢子悬液，充分搅拌均匀、无菌棉塞封好，然后将样品保存在28±1℃条件下，并于接种后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天分别测试样品中活细菌和活真菌含量。
1.2.3 检测判定标准：在要求接种浓度范围内，样品第14天微生物检出浓度不高于样品接种后浓度的0.1% ，第28天微生物无检出。
1.3 环境微生物激发实验：                                                                    
1.3.1 环境菌种及试剂：                                                                 G-粘质沙雷氏菌：生产用水放置一段时间后检出、划线分离、鉴定、保存；G 芽孢杆菌：环境空气检出、划线分离、鉴定、保存；G-浅金黄色假单胞菌：设备死角残留物检出、划线分离、鉴定、保存；奈瑟氏G-球菌：车间员工手部擦拭检出、划线分离、鉴定、保存；白色根霉：车间空气检出、点植分离、鉴定、保存； 互隔交链胞霉：车间空气检出、点植分离、鉴定、保存；青霉：车间空气检出、点植分离、鉴定、保存；红曲霉：车间空气检出、点植分离、鉴定、保存。卵磷脂-吐温80-营养琼脂培养基（Litithin Tween 80 Agur） ，马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA） ，普通营养琼脂培养基广东环凯公司生产；卵磷脂、吐温-80均为分析纯。
1.3.2 检测程序：同混合标准菌激发实验检测程序。
1.3.3 检测判定标准：在要求接种浓度范围内，样品第14天微生物检出浓度不高于样品接种后浓度的0.1% ，第28天微生物无检出。
2 结果与讨论：
2.1 USP法激发实验                                                                        将5种不同菌种分别配制成5个规定浓度的菌悬液，接入待测样品中，28℃放置，于1、3、7、14、21、28天进行样品检测，以根据标准评价化妆品防腐体系功效。结果如表1所示。
 表1  USP激发实验结果
样品编号　
A B C D
　

检测数据 铜绿假单胞菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 白色假丝酵母 铜绿假单胞菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 白色假丝酵母 铜绿假单胞菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 白色假丝酵母 铜绿假单胞菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 白色假丝酵母
菌悬液（cfu/ml) 3.0×108 4.5×108 2.0×108 1.6×108 1.0×107 3.0×108 4.5×108 2.0×108 1.6×108 1.0×107 3.0×108 4.5×108 2.0×108 1.6×108 1.0×107 3.0×108 4.5×108 2.0×108 1.6×108 1.0×107
样品接种后浓度（cfu/g） 3.0×106 4.5×106 2.0×106 1.6×106 1.0×104 3.0×106 4.5×106 2.0×106 1.6×106 1.0×104 3.0×106 4.5×106 2.0×106 1.6×106 1.0×104 3.0×106 4.5×106 2.0×106 1.6×106 1.0×104
第1天检出（cfu/g） 2.5×106 3.0×106 3.0×105 1.2×102 3.1×102 2.0×106 8.6×105 6.7×105 1.6×106 6.0×104 3.0×105 5.0×105 1.3×105 10 1.6×102 7.2×105 3.0×105 5.5×104 ＜10 2.6×103
第3天检出（cfu/g） 8.9×104 5.6×104 3.7×104 13 52 不可计 不可计 不可计 3.9×104 3.9×104 1.2×103 2.7×103 1.2×103 ＜10 ＜10 5.0×104 5.3×104 3.2×103 ＜10 6.8×102
第7天检出（cfu/g） 3.5×103 6.0×103 1.2×103 ＜10 ＜10 不可计 不可计 不可计 3.0×103 6.8×103 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 3.9×103 2.1×103 ＜10 ＜10 5.1×102
第14天检出（cfu/g） 7.5×103 3.2×103 1.3×102 ＜10 ＜10 不可计 不可计 不可计 6.2×102 6.2×102 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 7.2×102 4.3×102 ＜10 ＜10 31
第21天检出（cfu/g） 7.8×103 4.5×103 1.0×102 ＜10 ＜10 不可计 不可计 不可计 10 3.5×102 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
第28天检出（cfu/g） 9.5×103 5.0×103 50 ＜10 ＜10 不可计 不可计 不可计 20 3.4×102 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表1结果表明，样品A、B虽然可以通过某些单项菌种的挑战性（激发）实验，但根据判定标准综合判断，此二样品不能通过USP微生物激发实验，C、D可以同时满足每个菌种挑战性（激发）实验。
USP法为美国USP制订的防腐功效评价的第一份官方标准，本实验工作量大，比较适合（研究机构）关于防腐剂对某些标准菌种的抑杀效果研究。
2.2 混合标准菌激发实验：                                                                                         本试验方法是将8种不同的标准菌种分别配制成两组规定浓度的菌悬液，接入化妆品样品中，28℃放置，于1、3、7、14、21、28天进行样品检测，以根据标准评价化妆品防腐体系功效。结果如表2所示。
表：2混合标准菌激发实验结果
样品编号
 检测数据              A B C D
 标准细菌 标准霉菌 标准细菌 标准霉菌 标准细菌 标准霉菌 标准细菌 标准霉菌
菌悬液（cfu/ml) 1.8×108 2.0×107 1.8×108 2.0×107 1.8×108 2.0×107 1.8×108 2.0×107
样品接种后浓度（cfu/g） 1.8×106 2.0×105 1.8×106 2.0×105 1.8×106 2.0×105 1.8×106 2.0×105
第1天检出（cfu/g） 1.6×106 8.0×104 2.0×106 6.0×104 3.0×105 1.6×103 2.6×105 3.8×102
第3天检出（cfu/g） 2.5×104 ＜1.0×102 2.5×106 3.8×103 7.2×103 ＜10 3.9×104 2.1×102
第7天检出（cfu/g） 8.6×103 ＜10 不可计 6.0×103 ＜10 ＜10 3.0×103 1.2×102
第14天检出（cfu/g） 7.3×103 ＜10 不可计 4.6×103 ＜10 ＜10 1.3×103 20
第21天检出（cfu/g） 7.5×103 ＜10 不可计 3.1×103 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
第28天检出（cfu/g） 8.5×103 ＜10 不可计 4.9×103 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表2结果表明，样品C、D可以通过标准菌的微生物挑战性实验，样品A、B不能通过标准菌的微生物挑战性实验。
对比表1和表2可以看出：混合标准菌激发实验中，分别使用4种不同的标准菌种配制的混合菌种接入样品进行考察，相对于USP法分别使用单种菌种接入样品进行考察来讲，既能保证检测结果的客观性、准确性（两种方法实验结论一致），又能减少工作量降低检测费用，比较适合国内化妆品制造企业开展此项工作。
2.3 环境微生物激发实验                                                                      环境微生物激发实验是将8种不同的环境菌种（来源于化妆品生产环境）分别配制成两组规定浓度的菌悬液，接入化妆品样品中，28℃放置，于1、3、7、14、21、28天进行样品检测，以根据标准评价化妆品防腐体系功效。实验结果如表3
表3 混合标准菌与环境微生物激发对比实验结果
样品编号 C D
 标准菌 环境菌 标准菌 环境菌
检验结果 标准细菌 标准霉菌 环境细菌 环境霉菌 标准细菌 标准霉菌 环境细菌 环境霉菌
菌悬液（cfu/ml) 1.8×108 2.0×107 4.5×108 1.6×106 1.8×108 2.0×107 4.5×108 1.6×106
样品理论接种量（cfu/g） 1.8×106 2.0×105 4.5×106 2.0×104 1.8×106 2.0×105 4.5×106 2.0×104
第1天检出（cfu/g） 3.0×105 1.6×103 1.3×105 2.5×102 2.6×105 3.8×102 3.5×105 1.0×102
第3天检出（cfu/g） 7.2×103 ＜10 2.7×103 ＜10 3.9×104 2.1×102 7.9×104 ＜10
第7天检出（cfu/g） ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 3.0×103 1.2×102 1.2×105 ＜10
第14天检出（cfu/g） ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 1.3×103 20 1.3×106 ＜10
第21天检出（cfu/g） ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 不可计 ＜10
第28天检出（cfu/g） ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 不可计 ＜10
由表3结果可以看出 ，在要求接种浓度范围内，样品C第14天微生物检出浓度未高于样品接种浓度的0.1%，第28天微生物无检出。因此样品C 可以同时通过                                                         标准菌、环境菌的微生物挑战性实验，样品D可以通过标准菌的微生物挑战性实验但不能通过环境菌的微生物挑战性实验。
因为微生物的特性（分布广、适应能力强、易变异等），化妆品制造企业在实际制造环境中极易产生具有抗性的微生物---House Micro-organism，这类微生物对车间常用的消毒剂、某些产品防腐剂具有一定的“抗性”，极易污染化妆品。初始污染微生物量过大（一次污染），污染的“抗性”微生物在化妆品中如果未能被杀死而是处于抑制状态，这些微生物新陈代谢并未完全停止，其代谢物或因长期生长停滞导致死亡在细胞壁溶菌酶作用下自溶的细胞液可能“中和”一部分防腐剂，从而导致产品防腐体系抵御二次污染的能力下降，因此环境微生物对于防腐体系的挑战性（激发）实验更能客观模拟生产现状的微生物污染对于防腐体系功效的影响，本实验中样品D在生产、储运、销售、使用过程仍然容易受到污染。
3 结论：                               
 根据上述3两组实验结果，在国内化妆品制造企业开展混合标准菌激发实验，比USP法采用单种菌种更加实用，既能保证检测结果的客观性、准确性，又能减少工作量降低检测费用；而选用合适的环境菌进行等效激发实验则充分考虑了化妆品生产环境对防腐体系功效的影响。因此在实际应用当中采取同时对样品进行标准菌、环境菌挑战性实验来综合评价防腐体系功效，可以为化妆品制造企业预防控制微生物污染提供更有力的保障。
                                                                  

参考文献：
1.《化妆品化学与工艺技术大全》 （上册）                             裘炳毅
2.U.S.Pharmacopoeia XIX,Antimicrobial preservative-effectiveness,in United States Pharmacopoeia,19th rev ,1975 Mack Publishing,Easton,Pa.,pp.587-588
3.Anon:Microbiological tests,antimicrobial preservative-effectiveness,in United States PharmacopoeiaXX11,United States Pharmacopeial Convention Rockford,MD,1478—1479(1990)